Сравнительный анализ симплексной и дуплексной ПЦР для выявления фальсификации козьего молока и продуктов его термической обработки

Введение: Обеспечение безопасности и подлинности молока и продуктов его переработки – первостепенная задача молочного сектора промышленности. Современные молекулярно-генетические технологии позволяют обеспечить эффективное выявление фальсифицированной молочной продукции, а именно оценить наличие подмены одного вида молока другим. Однако исследований, посвященных молекулярной идентификации молочных продуктов, прошедших различные температурные режимы термической обработки, крайне мало. В связи с этим, актуальным направлением становится изучение влияния процессов нагревания молока на деградацию нуклеиновых кислот и последующий их анализ с помощью ПЦР-технологий для определения видового состава в пищевой промышленности.

Цель: Провести сравнительный анализ эффективности методов симплексной и дуплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения происхождения молока и продуктов его переработки, подвергнутых различной термической обработке.

Материалы и методы: Исследование выполнено в лаборатории прикладной микробиологии и геномики микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности. Объектами исследования выступали молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное, кисломолочные продукты на йогуртовой закваске и полученные на их основе бинарные молочные смеси крупного и мелкого рогатого скота. Данное исследование направлено на применение ПЦР-технологий для решения проблемы определения видового состава молока, полученного от коровы (Bos taurus) и козы (Capra hircus) и продуктов на их основе. Из образцов пищевых продуктов выделяли суммарную ДНК для последующего анализа методом симплексной и дуплексной ПЦР с помощью набора видоспецифических олигонуклеотидных праймеров.

Результаты: Было проведено сравнение чувствительности симплексного и дуплексного ПЦР-анализа продуктов на основе молока, в ходе которого было установлено, что относительный предел обнаружения коровьей ДНК при использовании дуплексного ПЦР-анализа ниже, чем симплексного, и составил 50 % для сырого молока, 10 % - для пастеризованного молока и кисломолочного продукта на йогуртовой закваске. Чувствительность обнаружения козьей ДНК при дуплексной и симплексной ПЦР оказалась на уровне 1 % за исключением смесей стерилизованного молока: в случае использования дуплексной ПЦР предел обнаружения козьей ДНК был ниже и составил 5 %.

Выводы: Молекулярно-генетические методы с использованием митохондриальных мишеней позволяют определять происхождение молока в молочной продукции. Возможности применения ПЦР при анализе молочных продуктов, прошедших термическую обработку, ограничены размером получаемых ампликонов. Тест-системы на основе ПЦР предоставляют широкие возможности для определения состава и выявления фальсификации продукции в молочной промышленности.

1. Агарков, К. В., & Пряничникова, Н. С. (2023). Актуальность разработки новых видов сухих смесей на молочной основе. Пищевые инновации и биотехнологии: Сборник тезисов XI Всероссийской (национальной) научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (с. 94–96). Кемерово: Кемеровский государственный университет.

2. Гильманов, Х. Х., Вафин, Р. Р., Блиадзе, В. Г., & Михайлова, И. Ю. (2020). Проблема фальсификации видовой принадлежности молока. Актуальные вопросы молочной промышленности, межотраслевые технологии и системы управления качеством, 1(1), 125-129. https://doi.org/10.37442/978-5-6043854-1-8-2020-1-125-129

3. Захарова, И.Н., & Сугян, Н.Г. (2021). Использование козьего молока в питании детей раннего возраста (клинические примеры). Медицинский совет, (17), 175-181. https://doi.org/10.21518/2079-701X-2021-17-175-181

4. Зимняков, В. М., Ильина, Г. В., Ильин, Д. Ю., & Зимняков, А. М. (2023). Состояние, проблемы и перспективы производства молока в России. Техника и технологии в животноводстве, 1(49), 4-10. https://doi.org/10.22314/27132064-2023-1-4

5. Зобкова, З. С., Фурсова, Т. П., & Зенина, Д. В. (2018). Выбор белковых ингредиентов, обогащающих и модифицирующих структуру кисломолочных напитков. Актуальные вопросы индустрии напитков, (2), 64-69. https://doi.org/10.21323/978-5-6041190-3-7-2018-2-64-69

6. Мельденберг, Д. Н., Полякова, О. С., Семёнова, Е. С., & Юрова, Е. А. (2020). Разработка комплексной оценки белкового состава молока сырья различных сельскохозяйственных животных для выработки продуктов функциональной направленности. Хранение и переработка сельхозсырья, (3), 118-133. https://doi.org/10.36107/spfp.2020.352

7. Меркушева, И. Н., Петриченко, С. П., & Кожухова, М. А. (2005). Пищевая и биологическая ценность козьего молока. Известия вузов. Пищевая технология, (2-3), 44-46.

8. Чарыков, В. И., Злыднев, А. Н. (2017). Анализ электрофизических методов пастеризации молока. Приоритетные направления развития энергетики в АПК, 1(1), 34-38.

9. Шегидевич, Е. Д. (2021). Изменение белкового состава молочного сырья при механической и термической обработке. Молодежь в науке-2021, 1(1),131-133.

10. Шувариков, А. С., Канина, К. А., Робкова, Т. О., & Юрова, Е. А. (2018). К вопросу оценки состава овечьего, козьего и коровьего молока. Овцы, козы, шерстяное дело, 1(1), 20-22.

11. Юрова, Е. А., Жижин, Н. А., & Фильчакова, С. А. (2020). Применение молекулярно-генетических методов анализа для идентификации видовой принадлежности сырьевого состава пищевой продукции. Вестник МГТУ, 23(3), 214-223. https://doi.org/10.21443/1560-9278-2020-23-3-214-223.

12. Barłowska, J., Wolanciuk, A., Litwińczuk, Z., & Król, J. (2012). Milk proteins’ polymorphism in various species of animals associated with milk production utility. Milk protein (pp. 235-264). InTech.

13. Caldwell, J. M., Pérez‐Díaz, I. M., Sandeep, K. P., Simunovic, J., Harris, K., Osborne, J. A., & Hassan, H. M. (2015). Mitochondrial DNA fragmentation as a molecular tool to monitor thermal processing of plant‐derived, low‐acid foods, and biomaterials. Journal of Food Science, 80(8), 1804-1814. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12937

14. De, S., Brahma, B., Polley, S., Mukherjee, A., Banerjee, D., Gohaina, M., Singha K., Singh R., Datta, T., Goswami, S. L. (2011). Simplex and duplex PCR assays for species specific identification of cattle and buffalo milk and cheese. Food Control, 22(5), 690-696. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.026

15. Deng, L., Li, A., Gao, Y., Shen, T., Yue, H., Miao, J., Li, R., Yang, J. (2020). Detection of the bovine milk adulterated in camel, horse, and goat milk using duplex PCR. Food Analytical Methods, 13, 560-567. https://doi.org/10.1007/s12161-019-01678-2

16. Galal‐Khallaf, A., Hussein, D., & El‐Sayed Hassab El‐Nabi, S. (2021). Single nucleotide polymorphism‐based methodology for authentication of bovine, caprine, ovine, camel, and donkey meat cuts. Journal of Food Science, 86(10), 4444-4456. https://doi.org/10.1111/1750-3841.15885

17. Golinelli, L. P., Carvalho, A. C., Casaes, R. S., Lopes, C. S. C., Deliza, R., Paschoalin, V. M. F., & Silva, J. T. (2014). Sensory analysis and species-specific PCR detect bovine milk adulteration of frescal (fresh) goat cheese. Journal of Dairy Science, 97(11), 6693-6699. https://doi.org/10.3168/jds.2014-7990

18. Guo, L., Qian, J. P., Guo, Y. S., Hai, X., Liu, G. Q., Luo, J. X., & Ya, M. (2018). Simultaneous identification of bovine and equine DNA in milks and dairy products inferred from triplex TaqMan real-time PCR technique. Journal of Dairy Science, 101(8), 6776-6786. https://doi.org/10.3168/jds.2018-14408

19. Handford, C. E., Campbell, K., & Elliott, C. T. (2016). Impacts of milk fraud on food safety and nutrition with special emphasis on developing countries. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15(1), 130-142. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12181

20. Hazra, T., Sharma, V., Sharma, R., & Arora, S. (2016). Simplex PCR assay for detection of cow milk presence in goat milk. Indian Journal of Dairy Science, 69(5), 621-625.

21. Hird, H., Chisholm, J., Sánchez, A., Hernandez, M., Goodier, R., Schneede, K., Boltz, C., Popping, B. (2006). Effect of heat and pressure processing on DNA fragmentation and implications for the detection of meat using a real-time polymerase chain reaction. Food Additives and Contaminants, 23(7), 645-650. https://doi.org/10.1080/02652030600603041

22. Kalle, E., Kubista, M., & Rensing, C. (2014). Multi-template polymerase chain reaction. Biomolecular Detection and Quantification, 2, 11-29. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2014.11.002

23. Kourkouli, A., Thomaidis, N., Dasenaki, M., & Markou, A. (2024). Novel and sensitive touchdown polymerase chain reaction assays for the detection of goat and sheep milk adulteration with cow milk. Molecules, 29(8), 1820. https://doi.org/10.3390/molecules29081820

24. Lad, S. S., Aparnathi, K. D., Mehta, B., & Velpula, S. (2017). Goat milk in human nutrition and health–a review. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci, 6(6), 1781-92. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.605.194

25. López-Calleja, I., González, I., Fajardo, V., Rodríguez, M. A., Hernández, P. E., García, T., & Martín, R. (2004). Rapid detection of cows' milk in sheeps' and goats' milk by a species-specific polymerase chain reaction technique. Journal of Dairy Science, 87(9), 2839-2845. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(04)73412-8.

26. Pokorska, J., Kułaj, D., Dusza, M., Żychlińska-Buczek, J., & Makulska, J. (2016). New rapid method of DNA isolation from milk somatic cells. Animal Biotechnology, 27(2), 113-117. https://doi.org/10.1080/10495398.2015.1116446

27. Putri, A. E., Farajallah, A., & Perwitasari, D. (2019). The origin of pesisir cattle based on D-loop mitochondrial DNA. Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 20(9). https://doi.org/10.13057/biodiv/d200919

28. Rodrigues, N. P. A., Givisiez, P. E. N., Queiroga, R. C. R. E., Azevedo, P. S., Gebreyes, W. A., & Oliveira, C. J. B. (2012). Milk adulteration: Detection of bovine milk in bulk goat milk produced by smallholders in northeastern Brazil by a duplex PCR assay. Journal of Dairy Science, 95(5), 2749-2752. https://doi.org/10.3168/jds.2011-5235

29. Stackebrandt, E. (2009). Phylogeny based on 16S rRNA/DNA. Encyclopedia of Life Sciences (ELS). John Wiley & Sons.

30. Tuncay, R. M., & Sancak, Y. C. (2022). Comparison of PCR methods for determination of different types of milk added to goat milk. Balıkesir Sağlık Bilimleri Dergisi, 11(3), 509-514. https://doi.org/10.53424/balikesirsbd.1139179

31. Wang, Z., Li, T., Yu, W., Qiao, L., Liu, R., Li, S., Zhao, Y., Yang, S., & Chen, A. (2020). Determination of content of camel milk in adulterated milk samples by normalized real-time polymerase chain reaction system based on single-copy nuclear genes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 100(8), 3465-3470. https://doi.org/10.1002/jsfa.10382.