Оптимизация молекулярно-генетического метода идентификации молочного сырья

Введение: В данной статье рассматривается актуальная проблема обеспечения качества и безопасности молочных продуктов путем борьбы с фальсификацией. В данном исследовании рассматривается проблема видовой фальсификации, в частности замена козьего молока коровьим из-за значительной разницы в стоимости. Разработка и внедрение новых средств обнаружения и идентификации такого рода фальсификации имеет решающее значение, так как применяющиеся традиционные методы, такие как электрофорез и хроматография, зачастую являются дорогостоящими и трудоемкими. В статье рассматривается использование молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), как более эффективного и точного средства выявления видовой фальсификации молока.  Такие методы, как ПЦР, обладают высокой специфичностью, чувствительностью, скоростью и возможностью проведения количественного и мультиплексного анализа.

Цель: Цель данной работы – оптимизация метода идентификации видовой принадлежности сырого молока при помощи ПЦР-скрининга с использованием маркеров ядерной ДНК.

Материалы и методы: Исследование, выполненное в Центральной лаборатории микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности, посвящено видовой идентификации молока крупного и мелкого рогатого скота с использованием специфического набора праймеров, комплиментарных консервативному участку гена амилогенина жвачных. Исследование включает в себя выделение суммарной ДНК из образцов сырого молока сельскохозяйственных животных с последующим ПЦР-скринингом и детекцией результатов по конечной точке.

ПЦР-анализ проводили в реакционных смесях объемом 25 мкл, включающих такие ключевые компоненты, как смесь 5xScreen Mix, специфические праймеры, образцы ДНК и не содержащую нуклеазы деионизированную воду. Программа амплификации включала этапы денатурации, отжига и элонгации в течение нескольких циклов.

Результаты: Эксперимент был направлен на оценку пригодности праймеров SE47 и SE48 для амплификации ядерной ДНК соматических клеток молока крупного рогатого скота (Bos taurus) и коз (Capra hircus). Первоначально при проведении ПЦР-реакции использовалась расчётная температура отжига 56°С, однако использование данного режима приводило к появлению многочисленных неспецифических ПЦР-продуктов, выявляемых на электрофореграмме. Для решения данной проблемы мы поэтапно повышали температуру отжига, что привело к значительному снижению синтеза неспецифических ампликонов и, в конечном итоге, достижению 100% специфичности амплификации при температуре отжига 70°С.

Выводы: Нам удалось оптимизировать систему детекции на основе ПЦР для определения видовой идентификации молока крупного и мелкого рогатого скота. Полученные результаты подтверждают возможность использования геномной ДНК соматических клеток молока для успешной амплификации видоспецифических ядерных маркеров, но сохраняется необходимость проведения дальнейших исследований для определения чувствительности ПЦР-системы и возможности её применения при анализе продуктов переработки молока.

1. Каледин, А.С., Слюсаренко, А.Г., Городецкий, С.И. (1980). Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus aquaticus YT1. Биохимия, 45(4), 644–651.

2.

3. Канина, К. А., & Жижин, Н. А. (2021). Изучение качества козьего молока и овечьего как сырья для производства молочных продуктов, З-46, 238.

4.

5. Макеева, И. А., Стратонова, Н. В., Пряничникова, Н. С., & Белякова, З. Ю. (2021). Российские молочные продукты: эволюция идентификации. Известия высших учебных заведений. Пищевая технология, (2–3), 10–13.

6. https://doi.org/10.26297/0579–3009.2021.2–3.2

7.

8. Петров, С. Н., Харзинова, В. Р., Костюнина, О. В., Доцев, А. В., & Зиновьева, Н. А. (2018). Разработка универсальной тест-системы для определения пола у видов семейства полорогих на основе анализа полиморфизма гена амелогенина. Генетика и разведение животных, (4), 3–9. https://doi.org/10.31043/2410–2733-2018–4-3–9

9.

10. Хуршудян, С. А., Пряничникова, Н. С., & Рябова, А. Е. (2022). Качество и безопасность пищевых продуктов. Трансформация понятий. Пищевая промышленность, (3), 8.

11.

12. Юрова, Е. А., Фильчакова, С. А. (2021). Разработка методик измерений, обеспечивающих проведение испытаний продукции по всему спектру показателей и идентификационных характеристик продукта. Идеи академика Владимира Дмитриевича Харитонова в наукоемких технологиях переработки молока (с. 243–262). Москва: ВНИМИ.

13.

14. Юрова, Е. А., Фильчакова, С. А., & Жижин, Н. А. (2020). Применение метода ПЦР-анализа для определения видового состава молочного сырья. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, (6), 16–25. https://doi.org/10.26897/0021–342Х-2020–6-16–25

15.

16. Ali, S., Farooq, I. (2019). A review of the role of amelogenin protein in enamel formation and novel experimental techniques to study its function. Protein & Peptide Letters, 26(12), 880–886. https://doi.org/10.2174/0929866526666190731120018

17. Banti, M. (2020). Food adulteration and some methods of detection, review. International Journal of Nutrition and Food Sciences, 9(3), 86–94.

18. https://doi.org/10.11648/j.ijnfs.20200903.13

19. Baptista, M., Cunha, J. T., & Domingues, L. (2021). DNA-based approaches for dairy products authentication: A review and perspectives. Trends in Food Science & Technology, 109, 386–397. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.01.043

20. Chen, R., Chang, L., Chung, Y., Lee, M., & Ling, Y. (2004). Quantification of cow milk adulteration in goat milk using high-performance liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry. Communications in Mass Spectrometry, 18(10), 1167–1171.

21. https://doi.org/10.1002/rcm.1460

22. Chen, T., Wang, L., Wang, J., & Yang, Q. (2017). A network diffusion model of food safety scare behavior considering information transparency. Complexity, 2017. https://doi.org/10.1155/2017/5724925

23. Choudhary, A., Gupta, N., Hameed, F., & Choton, S. (2020). An overview of food adulteration: Concept, sources, impact, challenges and detection. International Journal of Chemical Studies, 8(1), 2564–2573.

24. https://doi.org/10.22271/chemi.2020.v8.i1am.8655

25. Di Pinto, A., Conversano, M. C., Forte, V. T., Novello, L., & Tantillo, G. M. (2004). Detection of cow milk in buffalo “mozzarella” by polymerase chain reaction (PCR) assay. Journal of Food Quality, 27(6), 428–435.

26. https://doi.org/10.1111/j.1745–4557.2004.00662.x

27. Ennis, S., Gallagher, T.F. (1994). A PCR-based sex-determination assay in cattle based on the bovine amelogenin locus. Animal Genetics, 25(6), 425–427. https://doi.org/10.1111/j.1365–2052.1994.tb00533.x

28. Fekete, T., Šnirc, M., Belej, Ľ., Židek, R., Golian, J., Haščík, P., Zajác, P. (2017). Authentication of caprine milk and cheese by commercial qPCR assay. Potravinarstvo. https://doi.org/10.5219/780

29. Jianqin, S., Leiming, X., Lu, X., Yelland, G. W., Ni, J., & Clarke, A. J. (2015). Effects of milk containing only A2 beta casein versus milk containing both A1 and A2 beta casein proteins on gastrointestinal physiology, symptoms of discomfort, and cognitive behavior of people with self-reported intolerance to traditional cows’ milk. Nutrition journal, 15, 1–16.

30. https://doi.org/10.1186/s12937–016-0147-z

31. Liao, J., & Liu, Y. (2020). Extraction and detection of DNA from UHT milk during storage. CyTA-Journal of Food, 18(1), 747–752. https://doi.org/10.1080/19476337.2020.1839565

32. Lawyer, F.C., Stoffel, S., Saiki, R.K., Chang, S.Y., Landre, P.A., Abramson, R.D., Gelfand, D.H. (1993). High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity. Genome Research, 2(4), 275–87. https://doi.org/10.1101/gr.2.4.275

33. Mafra, I., Honrado, M., & Amaral, J. S. (2022). Animal species authentication in dairy products. Foods, 11(8), 1124.

34. https://doi.org/10.3390/foods11081124

35. Masuyama, K., Shojo, H., Nakanishi, H., Inokuchi, S., Adachi, N. (2017). Sex determination from fragmented and degenerated DNA by amplified product-length Polymorphism Bidirectional SNP analysis of Amelogenin and SRY genes. PLoS ONE, 12(1), e0169348. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169348

36. Maudet, C., & Taberlet, P. (2001). Detection of cows’ milk in goats’ cheeses inferred from mitochondrial DNA polymorphism. Journal of Dairy Research, 68(2), 229–235.

37. https://doi.org/10.1017/S0022029901004794

38. Miciński, J., Kowalski, I. M., Zwierzchowski, G., Szarek, J., Pierożyński, B., & Zabłocka, E. (2013). Characteristics of cow’s milk proteins including allergenic properties and methods for its reduction. Polish Annals of Medicine, 20(1), 69–76. https://doi.org/10.1016/j.poamed.2013.07.006

39. Nascimento, C. F., Santos, P. M., Pereira-Filho, E. R., & Rocha, F. R. (2017). Recent advances on determination of milk adulterants. Food chemistry, 221, 1232–1244.

40. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.11.034

41. Poonia, A., Jha, A., Sharma, R., Singh, H. B., Rai, A. K., & Sharma, N. (2017). Detection of adulteration in milk: A review. International journal of dairy technology, 70(1), 23–42.

42. https://doi.org/10.1111/1471–0307.12274

43. Prosser, C. G. (2021). Compositional and functional characteristics of goat milk and relevance as a base for infant formula. Journal of Food Science, 86(2), 257–265. https://doi.org/10.1111/1750–3841.15574

44. Rahmatalla, S. A., Arends, D., & Brockmann, G. A. (2022). Genetic and protein variants of milk caseins in goats. Frontiers in Genetics, 13, 995349. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.995349

45. Rodionov, G. V., Amerkhanov, K. A., Solovieva, O. I., Olesyuk, A. P., & Minero, C. S. M. (2021). Biotechnological methods to improve the quality and safety of milk. In BIO Web of Conferences (vol. 36, 05002). EDP Sciences.

46. https://doi.org/10.1051/bioconf/20213605002

47. Roy, D., Ye, A., Moughan, P. J., & Singh, H. (2020). Composition, structure, and digestive dynamics of milk from different species — A review. Frontiers in Nutrition, 7, 577759. https://doi.org/10.3389/fnut.2020.577759

48. Schmidt, J. M., Kjølbæk, L., Jensen, K. J., Rouy, E., Bertram, H. C., Larsen, T., ... & Hammershøj, M. (2020). Influence of type of dairy matrix micro-and macrostructure on in vitro lipid digestion. Food & function, 11(6), 4960–4972.

49. https://doi.org/10.1039/D0FO00785D

50. Smith-Howard, K. (2017). Pure and modern milk: An environmental history since 1900. Oxford University Press.

51. Trimboli, F., Costanzo, N., Lopreiato, V., Ceniti, C., Morittu, V. M., Spina, A., & Britti, D. (2019). Detection of buffalo milk adulteration with cow milk by capillary electrophoresis analysis. Journal of dairy science, 102(7), 5962–5970.

52. https://doi.org/10.3168/jds.2018–16194

53. Untergasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B.C., Remm, M., & Rozen, S.G. (2012). Primer3 — new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research, 40(15), e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596

54. Vafin, R. R., Galstyan, A. G., Tyulkin, S. V., Gilmanov, K. K., Yurova, E. A., Semipyatniy, V. K., & Bigaeva, A. V. (2022). Species identification of ruminant milk by genotyping of the κ-casein gene. Journal of Dairy Science, 105(2), 1004–1013.